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            甲狀腺轉錄因子-1(TTG-1)影響肺癌細胞血管生成

            更新時間:2016-06-03   更新時間:2016-06-03   點擊次數(shù):2307次

            美國的科研人員通過對TTF-1的調控發(fā)現(xiàn),TTF-1能直接調節(jié)血管內皮生長因子(VEGF),并且發(fā)現(xiàn)VEGF啟動子上有多處TTF-1響應序列。 比如,VEGF的主要受體,VRGFR2顯示出收到TTF-1的直接正調節(jié)。本文中顯示,低氧并沒有促進 TTF-1+肺癌細胞中的VEGF的表達。而采用外泌體培養(yǎng)基或者是去外泌體的培養(yǎng)基(EDM)時,TTF-1都能促進VEGF表達。但在研究中意外的發(fā)現(xiàn)TTF-1+肺癌細胞的去外泌體培養(yǎng)基(EDM-TTF-1+)能夠內皮細胞的血管形成。

            研究人員采用HUVECs,鋪在基質膠上,加入EDM以及VEGFR1等蛋白質后孵育2-3小時,對比不同條件下的分枝數(shù)和節(jié)點數(shù)。

            Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
            L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
            Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

            (一)實驗材料和實驗方法
            1)細胞:       HUVECs                                 104 cells/50μl
            2)培養(yǎng)基:      RPMI
            3)基質膠:    Basement membrane (Fisher Scientific, CB40234A)    10 µl per well
            4) 試劑:     A549 conditioned media (EDM)
                         Recombinant human GM-CSF protein(250ng/ml,Peprotech,300-03)
                         sVEGFR1 protein(20 ng/ml, RayBiotech,ELH-VEGFR1)
                         Anti-GM-CSF antibody (R&D systems. MAB215)
                         Anti-VEGFR1 antibody (R&D systems. AF321) 
            5)耗材:    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506) 
            6)其他:        細格紙                                   
                       

            (二)實驗步驟
            1)準備基質膠
            ① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內孔中,注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。
            ② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
            ③ 準備一個10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個濕盒。
            ④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。
            ⑤ 37℃至少孵育30分鐘,使基質膠固化。


            怎么知道加了合適體積的Matrigel:
            由于Matrigel流動性不強,并且有可能移液槍不準確,有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔,這樣,必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。

            如上圖所示,垂直透過每個孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。


            3)鋪細胞

            ① 在培養(yǎng)好的HUVECs細胞的60mm培養(yǎng)皿中加入5μg 的 Calcein-AM,染色45分鐘。
            ② 胰酶消化細胞制成懸液,每孔種10000個細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液,充分混勻。
            ③ 將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
            ④ 每孔加入50μl的細胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
            ⑤ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無細胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。
            ⑥ 蓋上蓋,靜置,一段時間后,所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

            4)不同培養(yǎng)基處理
            采用EDM-EV,EDM-HDD,EDM-TTF-1處理細胞,并分別加入 rGM-CSF和rsVEGFR1,以Goat Ab和 Mouse Ab作為對照。37℃,培養(yǎng)2-3小時。
            5)采集圖像并統(tǒng)計結果
            使用尼康TS100顯微鏡的40倍鏡采集圖像,并且用 ImageJ對其分枝數(shù)和節(jié)點數(shù)進行測量和統(tǒng)計。

            三)實驗結果


            如圖所示,使用EDM-TTF1處理的HUVECs血管生成被顯著的抑制。當加入GM-CSF和VEGFR1后,血管生成也被顯著的抑制,但當加入GM-CSF和VEGFR1的抗體后,血管生成的抑制也被取消,細胞又顯出很強的血管生成結果。說明TTF-1上調了GM-CSF和VEGFR1的表達,抑制了血管生成的進程。

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