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            傷口愈合/細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)新方法-如何劃出筆直均一的劃痕

            更新時(shí)間:2016-03-31   更新時(shí)間:2016-03-31   點(diǎn)擊次數(shù):6233次

            前言

                 傷口愈合實(shí)驗(yàn)是體外研究細(xì)胞遷移的一個(gè)有用的實(shí)驗(yàn)。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個(gè)空白的無細(xì)胞的地帶,然后對(duì)這個(gè)無細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察;這些邊緣的細(xì)胞會(huì)開始進(jìn)行遷移活動(dòng),并且終覆蓋整個(gè)無細(xì)胞的區(qū)域,重新互相接觸在一起。

            傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法

                 細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁后,使用移液槍的槍頭在貼壁細(xì)胞的中間劃過,人為造成一道傷口(劃痕),之后定時(shí)測(cè)量劃痕的寬度,進(jìn)而得到傷口愈合的細(xì)胞遷移數(shù)據(jù)

            實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn):

            1.手動(dòng)劃痕不能保證每次劃痕的一致;

            2.有時(shí)候在劃細(xì)胞的同時(shí)會(huì)刮壞一片細(xì)胞對(duì)劃痕的邊緣的細(xì)胞造成機(jī)械損傷

            3.如果培養(yǎng)皿底部還有包被蛋白的話,槍頭劃過,很可能傷害到包被,進(jìn)而影響到細(xì)胞遷移,結(jié)果便很難判斷是哪個(gè)因素造成了決定性的影響。

            4.定時(shí)測(cè)量劃痕的寬度,計(jì)算劃痕寬度隨時(shí)間推移的變化;在選取劃痕測(cè)量點(diǎn)時(shí),不可避免地引入了主觀誤差(人為選取了遷移結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期的點(diǎn));

              綜上,傳統(tǒng)的傷口愈合方法總是重復(fù)性不佳,對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的闡述說服力不足。

                   下面分享一種新方法,輕松得到筆直均一的劃痕!

            實(shí)驗(yàn)核心

                   使用傷口愈合插件制造筆直均一的劃痕(圖一)。

            實(shí)驗(yàn)方法     

            1. 實(shí)驗(yàn)材料
            • 細(xì)胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
            • 實(shí)驗(yàn)耗材:   ibidi 35 mm培養(yǎng)皿帶傷口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
            • 細(xì)胞培養(yǎng)基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
            • 細(xì)胞消化試劑:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
            • 滅菌鑷子
            • 倒置顯微鏡,如果需要進(jìn)行連續(xù)的觀測(cè)好搭配鏡載加熱孵育系統(tǒng)

             

            1. 實(shí)驗(yàn)步驟
            1. 鋪細(xì)胞(圖

            為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在做實(shí)驗(yàn)之前好進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定需要使用的細(xì)胞懸液的密度。我們建議,好將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為24小時(shí)后正好可以長(zhǎng)滿每個(gè)插件的小孔。

            • ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。
            • 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液,調(diào)整懸液濃度為3*10cells/ml,這樣24小時(shí)后,細(xì)胞能剛剛長(zhǎng)滿單個(gè)小孔。
            • ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入70μl的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。
            • 37C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。

             

             

            A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞。

             

            1. 形成劃痕

            當(dāng)所有細(xì)胞都貼壁并且剛剛長(zhǎng)滿的時(shí)候,就可以開始傷口愈合實(shí)驗(yàn)了。用鑷子將傷口愈合插件提出,之后加入新鮮的培養(yǎng)基,或者在培養(yǎng)基中加入刺激劑,然后觀察傷口愈合的情況。

            • 24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞前一天種的細(xì)胞做鏡檢。細(xì)胞要貼壁并且是剛剛長(zhǎng)滿每個(gè)孔。長(zhǎng)得過多移除插件時(shí)會(huì)帶走很多細(xì)胞,長(zhǎng)得過少,傷口愈合的效果很差。
            • 如圖所示,小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角,將插件移除。 

                       

            圖三:用鑷子移除插件

            • 移除插件后,要用顯微鏡檢查是否形成合格的劃痕(圖)。
            • 小心的清洗細(xì)胞,之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

             

            圖四 筆直均一的劃痕

             

            1. 采集并分析圖像

            一般傷口愈合實(shí)驗(yàn)都是采集一張劃痕的初始圖像,再在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)候采集一張劃痕愈合的圖像。我們建議可以在這個(gè)過程多做幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),這樣可以觀測(cè)到細(xì)胞遷移隨時(shí)間的變化特征。

            • 在顯微鏡下選取能同時(shí)看到劃痕和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像,劃痕的方向好在視野內(nèi)為水平或者垂直
            • MCF-7細(xì)胞每半小時(shí)采集一張圖片,一直持續(xù)到20小時(shí)。
            • 采用ibidi傷口愈合分析軟件,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的覆蓋面積,做出曲線圖,可以看到在大約11個(gè)小時(shí)的時(shí)候,細(xì)胞基本就已經(jīng)長(zhǎng)滿了,接下來幾個(gè)小時(shí)細(xì)胞覆蓋面積都不會(huì)發(fā)生變化(圖)。

             

            圖五(a)  顯微鏡下觀察細(xì)胞覆蓋面積的變化

             

            圖五(b)  細(xì)胞覆蓋面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

             

             

            實(shí)驗(yàn)總結(jié)對(duì)比

            1.本實(shí)驗(yàn)方法能得到重復(fù)性更好的劃痕(圖六);

            圖六 通過計(jì)算劃痕的面積可以看出,在多次實(shí)驗(yàn)中,槍頭劃痕(左圖)

            制造的劃痕面積數(shù)據(jù)波動(dòng)大,重復(fù)性差;ibidi傷口愈合插件(右圖)制造的劃痕面積數(shù)據(jù)統(tǒng)一,重復(fù)性良好

            2.不會(huì)刮壞細(xì)胞,也不會(huì)造成劃痕的邊緣的細(xì)胞機(jī)械損傷

            3.不會(huì)傷害到培養(yǎng)皿底部包被蛋白

             

            圖一:左圖表示槍頭劃過后,底部包被蛋白被劃傷,細(xì)胞遷移結(jié)果受到底部不均一的影響。右圖ibidi插件移除后底部的包被蛋白沒有被破壞。

             

            4.通過計(jì)算細(xì)胞覆蓋面積得出細(xì)胞遷移結(jié)果,避免人為選取測(cè)量點(diǎn),使數(shù)據(jù)更客觀。1天內(nèi)就能得到測(cè)量結(jié)果,實(shí)驗(yàn)分析更快更準(zhǔn)確。

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