細胞內(nèi)的鈣稱為細胞內(nèi)鈣，可受到高度調(diào)節(jié)；這種緊密的調(diào)節(jié)使細胞內(nèi)鈣成為了解細胞功能和信號動力學(xué)的較佳的工具，使其能夠在細胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應(yīng)的能力。

　　鈣：細胞過程的多功能指示劑

　　鈣信號可作為讀數(shù)來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應(yīng)的能力，并剖析所涉及的信號通路。有幾種細胞內(nèi)鈣的熒光指示劑是可用于研究細胞功能；能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過程中的細胞反應(yīng)。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細胞的活細胞成像，其中熒光的增加表明細胞內(nèi)鈣的增加。

　　鈣指示劑的種類及其應(yīng)用

　　鈣指示劑主要分為兩大類：化學(xué)指示劑和基因編碼的鈣指示劑。可用于活細胞成像實驗的鈣指示劑類型取決于預(yù)期的細胞系、成像長度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預(yù)期結(jié)果等因素。

　　1.預(yù)期細胞系：

　　對于原代細胞系直接的方法是使用熒光染料，將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養(yǎng)的細胞中，并在孵育期后成像。

　　與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩(wěn)定。在活細胞成像中，熒光染料可以有效地進行短期活細胞成像，但隨著時間的推移細胞有排出染料的趨勢。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映，類似于在天然組織中的表達。

　　在廣泛的鈣信號傳導(dǎo)實驗中，已建立的細胞系是可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達遺傳編碼的鈣指示劑，如GCaMP、黃色cameleon等。對現(xiàn)有的不同基因編碼鈣指示劑進行改進，使指示劑更亮，光穩(wěn)定性更好，動態(tài)范圍更大，從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是細胞系中使用的一種較佳的工具，它將允許您選擇的指示劑在細胞系中穩(wěn)定表達。基因編碼報告系統(tǒng)的一個潛在問題是，并非所有細胞系都容易被轉(zhuǎn)導(dǎo)。　　

　　在用ADP 進行激動劑治療期間，人腸道類器官單層的實時、短期成像。這些有機體單層以綠色表達鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動劑，用于在細胞中引發(fā)細胞內(nèi)鈣信號傳導(dǎo)。激動劑治療是測試治療劑量反應(yīng)的較的好方法。

　　2.成像長度

　　對于活細胞成像，時間長度和間隔是需要記住的重要參數(shù)。細胞成像過程中的主要關(guān)注的是光漂白和光毒性。應(yīng)避免持續(xù)使用激發(fā)光，重要的是選擇足夠強的曝光時間和光功率，以檢測鈣信號，但不要過強，以免對細胞造成損害。成像的長度將取決于實驗。對于測試激動劑或細胞反應(yīng)，這通常是5-20分鐘的較短成像運行，每1-2秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復(fù)或病毒感染期間鈣信號傳導(dǎo)的實驗，我們會在18-20小時內(nèi)成像，每分鐘捕捉一次圖像。　　

　　活細胞成像的技巧

　　考慮要使用的細胞系是很重要的。為了研究鈣動力學(xué)，使用形成單層的細胞系將確保感興趣的區(qū)域保持聚焦，以捕捉信號動力學(xué)，從而獲得較佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化。對于涉及細胞間通訊和鈣動力學(xué)的實驗，細胞系融合也是一個重要的考慮因素。為了獲得質(zhì)量的圖像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃載玻片而不是光學(xué)級塑料載玻片，因此最好測試腔室載玻片。我們的細胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片。　　

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　　活細胞成像是使細胞的密度允許形成一個融合的單層，但不會導(dǎo)致細胞過度擁擠和團塊。在成像過程中需要使用合適的培養(yǎng)基。許多傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)基含有酚紅，它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實信號。因此，重要的是用PBS洗滌細胞，并用無酚紅培養(yǎng)基或市售的用于活細胞成像的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基。